ピーター・パーカー（トビー・マグワイア）は、新聞社デイリービーグルでバイトをしながら、大学に通っている。一方、ＭＪ（キルスティン・ダンスト）は念願の夢だった舞台女優としてのキャリアをスタートさせる。また親友ハリー（ジェームズ・フランコ）は、自分の父を殺したのはスパイダーマンだと思い込み、彼を倒すことを誓っていた。こうした人間関係と、疲労で学業に集中できないことに悩みながらも、ピーターはスパイダーマンとしてニューヨークの街を日々守っている。だがそんな彼の前に、2年前に倒したグリーン・ゴブリンを超える強敵が現われた。
